ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ

Στόχοι εργαστηρίου

Προαπαιτούμενες γνώσεις για το εργαστηριακό μέρος

1) Πως παρασκευάζουμε διαλύμματα
2) Πως αραιώνουμε διαλύμματα
3) Τι είναι προσιφώνιο, σιφώνιο, μικροσιφώνιο.

1. Εισαγωγή στην φασματομετρία

Σελίδες 10-19

2. Κατανόηση του μεγίστου μήκους κύματος απορρόφησης μιας ουσίας, λmax
3. Διατύπωση και κατανόηση των συνεπειών του νόμου των Bouget-Lambert-Beer (BLB).
4. Γνώση και σχέση μεταξύ απορροφητικότητας (Α) ή οπτικής πυκνότητας (OD) και διαπερατότητας (Τ).

5. Σπουδαιότητα του συντελεστή μοριακής απορροφητικότητας, Εm. Μονάδες μέτρησης και ποιά είναι η σημασία του στη φασματοσκοπία. Ένας άλλος, πιο χρηστικός ορισμός του Em: Είναι η απορροφητικότητα ενώσεως ανά μονάδα συγκεντρώσεως, C, και ανά μονάδα διανυθέντος μήκους της μονοχρωματικής ακτίνας (που δεν μεταβάλλεται) μέσω διαλύματος της ενώσεως. 

Συνέπεια: Όσο μεγαλύτερος είναι ο Em ενώσεως τόσο πιο πολύ απορροφά/μονάδα C και επομένως τόσο λιγότερη συγκέντρωση  χρειαζόμαστε για να την ανιχνεύσουμε.

 6. Πως υπολογίζεται ο Em. Πείραμα 1ο, σελ. 16.
7. Πως υπολογίζεται η συγκέντρωση, c, αγνώστου δείγματος.
Με 2 μεθόδους, α) Απόλυτη μέθοδος: Πρέπει να είναι γνωστές οι: Em και Α, από τον νόμο BLB. β) Συγκριτική μέθοδος: Πρότυπο διάλυμα γνωστών συγκεντρώσεων δίνει Αγ όπως και το άγνωστο διάλυμα Αα.
8. Αποκλείσεις από τον νόμο των BLB
9. Τι είναι η καμπύλη φάσματος απορρόφησης φασματος, και λmax, και πως μετράται. Πείραμα 1ο, σελίδα 16.
10. Τι είναι και πως κατασκευάζεται η πρότυπη καμπύλη απορρόφησης.
11. Κατανόηση των μερών και της λειτουργίας του φωτόμετρου.
12. Πως μετράται η συγκέντρωση άγνωστης ουσίας με βάση την πρότυπη καμπύλη της από γνωστές συγκεντρώσεις. Πείραμα 2ο σελ. 17.

Η ενέργεια ακτινοβολίας δίνεται από την εξίσωση: Ε=hv=hc/λ


Στοιχειώδης εισαγωγή 5 σελιδων στις αρχές της φασματοσκοπίας
Αρχές φασματοσκοπίας

2. Υποδειγματικές ασκήσεις

1. Να υπολογιστεί η απορροφητικότητα, Α, διαλύματος της πρωτεΐνης κυτοχρώματος C. Δίνονται: l=1 cm, c=0,5 mg/ml, Em=153000 1/M 1/cm και MB=13370 g/mol. 

2. Διαλυμα καθαρής αλβουμίνης χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή πρότυπης καμπύλης (με την μέθοδο προσδιορισμού της συγκέντρωσης πρωτεϊνών κατά Lowry) και έδωσε τα πιο κάτω αποτελέσματα.

BSA (Αλβουμίνη), μg/μl         0        20             40           60          80           100
A                                             0        0,05          0,10         0,15      0,20         0,23

Κατασκευάστε την πρότυπη καμπύλη.

α) Ποιά συγέντρωση έδωσε Α=0.12
β) Ποιά είναι η συγκέντρωση του διαλύματος όταν Α=0,25

  3. Ερωτήσεις ανασκόπησης

 1. Δώστε τους ορισμούς της απορροφητικότητας (Α), του φάσματος Α, της μοριακής απορροφητικότητας Εm και της διαπερατότητας.

2. Διατυπώστε τον νόμο των Bouget-Lambert-Beer και εξηγείστε με την εξίσωση των BLB γιατί η απορροφητικότητα είναι αδιάστατο μέγεθος.

3. Ποιές είναι οι διαστάσεις της Em ;

4. Σε ποιό νόμο στηρίζεται η φασματομετρία ;

5. Γιατί χρησιμοποιούμε τυφλό στις μετρήσεις της Α ;

4. Ερωτήσεις για περαιτέρω μελέτη

1. Παρ' όλο που η απορροφούμενη ηλεκτρομαγνητική ενέργεια των φωτονίων (hv) είναι κβαντισμένη, τα φάσματα απορρόφησης είναι συνεχή. Να εξηγήσετε γιατί. 

2. Ο συντελεστής Em εκφραζεται σε L/mol/cm. Από τί εξαρτώνται οι μονάδες του Em ;

3. Ποιά είναι η Α διαλύματος ουσίας όταν l=1 cm και Em=3782 L/mol/cm ;

4. Πως η Em μιας ουσίας επηρεάζει τη ευαισθησία του φασματοφωτομέτρου ;

5. Έχετε δυο ουσίες με Em ίσο με 10000 και 20 αντίστοιχα: Ποιά είναι πιο έυκολο να ανιχνευτεί αι γιατί ;

5. Ποιά η σημασία της Em στην φασματομετρία ;

5. Ερωτήσεις εργαστηριακού βιβλίου 

 Προσπαθήστε να απαντήσετε τις ερωτήσεις στην σελίδα 19

ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ-pH

Τι θα μάθετε στο εργαστήριο "Υδατικά Διαλύματα"

Α) Θεωρία, βιβλίο ασκήσεων, σελ. 1-5

Αμφίδρομες χημικές αντιδράσεις, σταθερά ισορροπίας Κi (Κa για οξέα)
Ορισμός ρυθμιστικών διαλυμάτων (ΡΔ) και χρήση, Σελ. 1
Αραίωση διαλυμάτων, σελ. 3
Μοριακότητα, κανονικότητα, % κατ' όγκον σύσταση διαλυμάτων 
pH, ορισμός και μέτρηση, σελ. 3-5
Παραδείγματα παρασκευής ΡΔ, σελ. 2-3
Δείκτες, σελ. 4-5

Β) Άσκηση, βιβλίο ασκήσεων, σελ. 6-10

Άσκηση 1η: Προσδιορισμός του pH αγνώστου διαλύματος με χρωματομετρία και pH-μετρο

Άσκηση 2η: Παρασκευή ΡΔ οξικού οξέως/οξικού νατρίου, 0.1 Μ και pH=5,0

Άσκηση 3η: Ρυθμιστική δράση του διαλύματος της 2ης άσκησης με τιτλοδότηση

ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ, pH - ΑΣΚΗΣΕΙΣ & ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΑ

1) Ιδιότητες Ρυθμιστικού Διαλύματος: 

Το αμινοξύ γλυκίνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ρυθμιστικό διάλυμα σε βιοχημικά πειράματα. Η αμινομάδα έχει pK=9,6 και υπάρχει είτε στην πρωτονιωμένη, είτε στην ελεύθερη μορφή: (R-NH+/R-NH2).

α. Να γράψετε την εξίσωση της αντιστρεπτής ισορροπίας της αμινομάδας.

β. Σε ποιό εύρος του pH μπορεί να χρησιμοποιηθεί η γλυκίνη ως ρυθμιστικό διάλυμα χάρη στην αμινομάδα της ;

γ. Πόσο επί τοις % της -ΝΗ3+ παραμένει αδιάστατο σε pH 10,6 ; σε pH 9,6 ; σε pH 8,6;

2) Η επίδραση του pH στην διαλυτότητα: 

 Ποιά είδη χημικών ενώσεων μπορούν να διαλυθούν στο νερό και γιατί;

Οι δεσμοί υδρογόνου που σχηματίζει το νερό οφείλονται στον πολικό του χαρακτήρα. 

Πολικά (υδροφιλα, φορτισμένα) μόρια διαλύονται εύκολα σε νερό ενώ μη πολικά μόρια έχουν ελάχιστη διαλυτότητα, είναι υδρόφοβα. Συνεπώς, αν ένα μόριο αποκτήσει πολικότητα μπορεί, θεωρητικά, να διαλυθεί στο νερό.

Επί παραδείγματι, η διαλυτότητα του βενζοϊκού οξέος (πιό κάτω σχήμα: pK=5) στο νερό είναι μικρή ενώ του βενζοϊκού ιόντος μεγαλύτερη. 

α. Πως μπορεί να αυξηθεί η διαλυτότητα του βεζοϊκού οξέος σε υδατικό διάλυμε; Νύξη: Γράψτε την εξίσωση ιοντισμού του βενζοϊκού.

β. Παρατηρείστε τις ενώσεις (πυριδίνη κλπ) στο πιο κάτω σχήμα: Είναι περισσότερο διαλυτές σε υδατικό διάλυμα 0,1 Μ ΝαΟΗ ή 0,1Μ ΗCl και γιατί;

3) pH και απορρόφηση φαρμάκων:

Η ασπιρίνη (οράτε το σχήμα, κάτω δεξιά) είναι ασθενές οξύ με pK=3,5. Απορροφάται από τα κύτταρα στο στομάχι και στο λεπτό έντερο, μέσω της κυτταρικής μεμβράνης. Η ταχύτητα απορρόφησης καθορίζεται από την πολικότητα του μορίου: Τα φορτισμένα ή πολικά μόρια διέρχονται αργά δεδομένου ότι οι μεμβράνες αποτελούνται από υδρόφοβα μόρια (φωσφολιπίδια κ.α.) ενώ τα ουδέτερα ή υδρόφοβα τις διαπερνούν γρήγορα. Το pH του γαστρικού υγρού είναι 1,5 ενώ το pH του περιεχομένου του λεπτού εντέρου περίπου 6,0. 

α) Από που απορροφάται περισσότερη ασπιρίνη ; Στο στομάχι ή στο λεπτό έντερο ; Νύξη: Χρησιμοποιείστε την εξίσωση Η-Η.

β)  Γιατί το pK της καρβοξυλικής ομάδας στην ασπιρίνη είναι υψηλότερο του pΚ της καρβοξυλικής ομάδας πχ. στο οξικό οξύ;

ΝΕΦΡΙΚΗ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑ

Ευχαριστώ τον Κο. Κολιάκο και την Κα. Μακέδου για το αρχείο του εργαστηρίου και τις οδηγίες για την εκτέλεσή του.

Τι πρέπει να γνωρίζετε :

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

1) Ταξινόμηση κυρίων νεφρικών λειτουργιών (σημεία 1-5).

2) Ουρία: Μεταβολές επιπέδων, φυσιολογικά επίπεδα, τι προκαλεί την αυξησή της: Αζωθαιμία.

3) Ομοιότητες/διαφορές προ- και μετανεφρικών παραγόντων αζωθαιμίας. 

4) Κρεατινίνη: Μεταβολές επιπέδων, φυσιολογικές τιμές και μέτρηση.

5) Τι είναι ο Ρυθμός Σπειραματικής Διήθησης, ΡΣΔ (Glomerular Filtration Rate, GFR). Πως υπολογίζεται.

6) Ουρικό οξύ: Φυσιολογικά επίπεδα και μεταβολές. 

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Πείραμα 1: Προσδιορισμός ουρίας στα ούρα

Πείραμα 2: Προσδιορισμός κρεατινίνης

Πείραμα 3: Προσδιορισμός ουρικού οξέως.

Από τα αποτελέσματα να εικτιμήσετε αν οι συγκεντρώσεις των πιο πάνω ενώσεων είναι φυσιολογικές.

 

ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Εργαστήριο Παρασκευής 3 Μαΐου, 2018

Κολιάκος Γεώργιος, Καθηγητής

Μακέδου Καλή, Επίκουρη Καθηγήτρια

Ορισμένες σημαντικές λειτουργίες των νεφρών:

1  1. Παραγωγή των ούρων, με τα οποία αποβάλλονται από τον οργανισμό όλα τα άχρηστα προϊόντα του μεταβολισμού των διαφόρων ουσιών, αλλά και άλλες τοξικές ουσίες

2  2. Διατήρηση του ισοζυγίου νερού – ηλεκτρολυτών και ρύθμιση της οξεοβασικής ισορροπίας

3  3. Ογκοεξαρτώμενη ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης

4  4. Καταβολισμός πεπτιδίων, π.χ. ινσουλίνης

5  5. Παραγωγή ορμονών:

α)  της ρενίνης, για τη ρύθμιση της αρτηριακής πίεσης

β) της ερυθροποιητίνης, για τη ρύθμιση της παραγωγής των ερυθρών αιμοσφαιρίων από το μυελό των οστών

γ)  της βιταμίνης D [1,25 (OH)₂D₃], για την απορρόφηση του ασβεστίου από το γαστρεντερικό σωλήνα.

Ουρία αίματος

      Η ουρία CO(NH₂)₂ παράγεται συνεχώς στο ήπαρ, με τον κύκλο της ουρίας, σαν τελικό προϊόν του μεταβολισμού των πρωτεϊνών και αποβάλλεται συνεχώς από τους νεφρούς. Οι ποσότητες της ουρίας που παράγονται και αποβάλλονται κατά τη διάρκεια της ημέρας δεν είναι σταθερές, δεδομένου ότι είναι συνάρτηση των πρωτεϊνών που λαμβάνονται με την τροφή. Για το λόγο αυτό και η συγκέντρωσή της στο αίμα δεν είναι σταθερή. 

            Αύξηση της ουρίας, που καλείται αζωθαιμία, μπορεί να εμφανισθεί σε όλες τις νόσους του παρεγχύματος του νεφρού, όπως νεφρίτιδα, προχωρημένη πυελονεφρίτιδα, νεφροσκλήρυνση, κακοήθη νεοπλάσματα του νεφρού, αλλά και σε ισχαιμία στο νεφρό. Αύξηση της ουρίας, όμως, μπορεί να οφείλεται και σε άλλους προνεφρικούς ή μετανεφρικούς παράγοντες.

Προνεφρικοί παράγοντες μπορεί να είναι:

·         τροφή πλούσια σε πρωτεΐνες

·         ελαφρά αφυδάτωση

·         αυξημένος μεταβολισμός των πρωτεϊνών, όπως σε νοσήματα φθοράς των μυών, σε οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου και καρδιακή ανεπάρκεια

·         επαναρρόφηση πρωτεϊνών από το έντερο, όπως σε αιμορραγία από το γαστρεντερικό και έγκαυμα

·         πείνα και

·         λήψη φαρμάκων, όπως η κορτιζόνη.

Στην προνεφρική αζωθαιμία δεν είναι ταυτόχρονα αυξημένη και η κρεατινίνη.

Μετανεφρικοί παράγοντες που προκαλούν μετανεφρική αζωθαιμία είναι η απόφραξη των ουρητήρων, της κύστης ή της ουρήθρας, η νεφρολιθίαση, η υπερτροφία του προστάτη και γενικότερα αποφρακτικά νοσήματα του ουροποιητικού. Σε αυτές τις περιπτώσεις είναι αυξημένη και η κρεατινίνη.

Οι φυσιολογικές τιμές της ουρίας αίματος στους ενήλικες είναι 22-40 mg/dl. Το άζωτο της ουρίας (BUN) υπολογίζεται πολλαπλασιάζοντας τη συγκέντρωση της ουρίας με τον αριθμό 0,4665.                                                                                                                            

Κρεατινίνη αίματος

            Η κρεατινίνη είναι ανυδρίτης της κρεατίνης, που συντίθεται στο ήπαρ, το πάγκρεας, το νεφρό και μεταφέρεται με το αίμα στους μυς και στον εγκέφαλο. Εκεί πραγματοποιείται φωσφορυλίωσή της σε φωσφορική κρεατίνη, η οποία και αποτελεί την ταχύτερη πηγή ανασύνθεσης του ATP, με τη βοήθεια του ενζύμου κρεατινική κινάση (CK). Ένα μικρό ποσοστό της κρεατίνης, 1-2%, μετατρέπεται σε  κρεατινίνη, η οποία μεταφέρεται στους νεφρούς προς αποβολή. Εκεί διηθείται πλήρως από το νεφρικό σπείραμα, ένα  μικρό ποσοστό επαναρροφάται και ένα ακόμη μικρότερο εκκρίνεται ενεργητικά από τα νεφρικά σωληνάρια.

Η συγκέντρωση της κρεατινίνης παραμένει σταθερή και είναι χαρακτηριστική για κάθε άνθρωπο. Μικρές μεταβολές, όπως αύξηση σε υγιές άτομο, μπορεί να οφείλονται σε κατανάλωση μεγάλης ποσότητας κρέατος. Η συγκέντρωσή της στο αίμα εξαρτάται από τη μάζα των μυών του σώματος, γι’ αυτό και είναι μεγαλύτερη στους άνδρες από ό,τι στις γυναίκες και στα παιδιά. Φυσιολογικά, τα επίπεδά της πρέπει να είναι 0,6 - 1,4mg/dl για τους άνδρες και 0,5 - 1,1mg/dl για τις γυναίκες.

Αύξηση των επιπέδων της κρεατινίνης, μόνη ή σε συνδυασμό με την ουρία, μπορεί να παρατηρηθεί σε διαταραχές του ρυθμού της σπειραματικής διήθησης, που μπορεί να προκληθεί σε νοσήματα του νεφρικού παρεγχύματος, οπότε διαταράσσεται η νεφρική λειτουργία, σε απόφραξη των ουροφόρων οδών, σε συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια και σε κακή αιμάτωση των νεφρών, όπως σε καταπληξία και αφυδάτωση. Η συγκέντρωση της κρεατινίνης στο αίμα, όμως, αυξάνεται και σε άλλα νοσήματα που χαρακτηρίζονται από αυξημένη παραγωγή και μεταβολισμό της κρεατίνης, όπως σε μεγαλακρία και γιγαντισμό, μυϊκή δυστροφία, πολυμυελίτιδα, μυασθένια Gravis, δερματομυοσίτιδα, υπερθυρεοειδισμό, κ.α. Ελάττωση της συγκέντρωσης της κρεατινίνης μπορεί να παρατηρηθεί σε περιπτώσεις μείωσης της μυϊκής μάζας και στην κύηση.

Ρυθμός σπειραματικής διήθησης και πλασματική κάθαρση κρεατινίνης: Αν μια ουσία που υπάρχει στο αίμα διηθείται ελεύθερα από τα νεφρικά σπειράματα, αν δεν επανρροφάται και δεν εκκρίνεται ενεργητικά από τα νεφρικά σωληνάρια, τότε ο ρυθμός αποβολής αυτής της ουσίας με τα ούρα δείχνει τη διηθητική ικανότητα, και κατ’ επέκταση τη λειτουργικότητα, του νεφρικού σπειράματος, και καλείται Ρυθμός Σπειραματικής Διήθησης (Glomerular Filtration Rate, GFR). Όσο μεγαλύτερος είναι αυτός ο ρυθμός, τόσο πιο γρήγορα θα αποβάλλεται η ουσία αυτή στα ούρα.

Πλασματική κάθαρση της κρεατινίνης είναι το υποθετικό ποσό του πλάσματος που απαλλάσσεται από την κρεατινίνη, όταν διέρχεται από τα νεφρικά σπειράματα, στη μονάδα του χρόνου (min). Όταν δεν διαταράσσεται η νεφρική λειτουργία πρέπει να ισούται με το ποσό του πλάσματος που διηθείται στο λεπτό, που για τους ενήλικες είναι 125-135 ml/min. Ο υπολογισμός της κάθαρσης της κρεατινίνης αντανακλά το ρυθμό σπειραματικής διήθησης και γίνεται από τη σχέση

                                      C_cr  = U_cr * V / P_cr

όπου C_cr: η κάθαρση κρεατινίνης

         U_cr: η συγκέντρωση κρεατινίνης σε δείγμα ούρων συλλογής 24ώρου

          V: ο ρυθμός ροής των ούρων (συνολικός όγκος ούρων σε 24 ώρες)

    P_cr: η συγκέντρωση της κρεατινίνης στο πλάσμα.

Σε σοβαρή νεφρική ανεπάρκεια, τα επίπεδα της κρεατινίνης στο πλάσμα είναι πιο αντιπροσωπευτικά του ρυθμού σπειραματικής διήθησης απ’ ότι η κάθαρση της κρεατινίνης, η οποία είναι ψευδώς υψηλότερη.

Ουρικό οξύ αίματος

            Το ουρικό οξύ είναι το τελικό προϊόν του μεταβολισμού των πουρινών του οργανισμού αλλά και των πυρηνοπρωτεϊνών της τροφής. Κατά τη διάσπαση των πουρινών η αδενίνη οξειδώνεται σε υποξανθίνη και αυτή, στη συνέχεια, σε ξανθίνη με τη δράση της οξειδάσης της ξανθίνης, που είναι ένα ένζυμο του ήπατος. Το μεγαλύτερο μέρος του ουρικού οξέος βρίσκεται στο αίμα και λιγότερο στα κύτταρα. Η συγκέντρωσή του, όμως, στο αίμα δεν είναι σταθερή.

Το ουρικό οξύ αποβάλλεται κατά 75% από τα ούρα και κατά 25% από τα κόπρανα. Όλο το ουρικό οξύ διηθείται από τα νεφρικά σπειράματα και, σχεδόν όλο, επαναρροφάται από τα εγγύς εσπειραμένα σωληνάρια. Το ουρικό οξύ τελικά αποβάλλεται στα ούρα από τα άπω εσπειραμένα σωληνάρια. Φυσιολογικά τα επίπεδά του στο αίμα είναι 2,4-5,7mg/dl για τις γυναίκες και 3,4-7mg/dl για τους άνδρες.

Αύξηση των επιπέδων του ουρικού οξέος στο αίμα εμφανίζεται:

1. Σε καταστάσεις που χαρακτηρίζονται από αυξημένο καταβολισμό πουρινών, όπως η λευχαιμία, η αιμολυτική ή η κακοήθης αναιμία, το πολλαπλούν μυέλωμα, οι οξείες λοιμώξεις, η ακτινοβολία, σε καταστροφή ιστών, όπως σε πνευμονία, εκλαμψία, στεφανιαία νόσος και σε άλλες παθήσεις, όπως υπερλιποπρωτεϊναιμίες, υποθυρεοειδισμό, κ.α.

2. Σε νεφρική βλάβη, σε ανεπάρκεια δηλαδή του νεφρού να διηθεί. Τα επίπεδά του ουρικού οξέος σε νεφρική ανεπάρκεια αυξάνονται, όμως, αργότερα από εκείνα της ουρίας και της κρεατινίνης.

3. Σε ουρική αρθρίτιδα, κατά την οποία κρύσταλλοι ουρικού οξέος εναποτίθενται στους γύρω από τις αρθρώσεις ιστούς ή και μέσα στην άρθρωση, στο νεφρικό παρέγχυμα με αποτέλεσμα το σχηματισμό νεφρολίθων.

4. Σε προεκλαμψία στην εγκυμοσύνη, πριν ακόμη διαταραχθεί η νεφρική λειτουργία

5. Σε γενετική ανεπάρκεια του ενζύμου οξειδάση της ξανθίνης, κατάσταση που καλείται συγγενής υπερουριχαιμία

6. Σε πρωτοπαθή νεανική υπερουριχαιμία ή Σύνδρομο Lesch-Nyhan, συγγενής φυλοσύνδετη νόσος που εκδηλώνεται στα αγόρια.

Ελάττωση των επιπέδων του ουρικού οξέος παρατηρείται σπανιότερα σε Νόσο Wilson (ηπατοφακοειδή εκφύλιση), σε σύνδρομο Fanconi, σε μεγαλακρία, και σε ινσουλινοθεραπεία.

 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

ΠΕΙΡΑΜΑ 1. Προσδιορισμός ουρίας στον ορό αίματος

Αρχή της Μεθόδου

Η μέθοδος είναι ενζυματική και στηρίζεται στην υδρόλυση της ουρίας με το ένζυμο ουρεάση, παρουσία νερού, παράγοντας αμμωνία. Η αμμωνία που παράγεται αντιδρά με το οξογλουταρικό και NADH, με την παρουσία της γλουταμικής δεϋδρογονάσης και δίνει γλουταμικό και NAD⁺. H κατανάλωση του NADH που υπολογίζεται με τη μείωση της απορρόφησης στο υπεριώδες (340nm) είναι ανάλογη με την ποσότητα της ουρίας του δείγματος.

ουρεάση

 

Ουρία  +   2Η₂Ο                                  2ΝΗ₄⁺ +          CO₃^2-

Γλουταμική δεϋδρογονάση

 

α-κετογλουταρικό + 2ΝΗ₄⁺ + NADΗ                                             L-γλουταμικό + NAD⁺ + Η₂Ο

Υλικά

Αντιδραστήριο 1         (Tris buffer pH 7,8  120mmol/l

ADP 750mmol/l

Ουρεάση ≥ 40KU

Γλουταμική δεϋδρογονάση     ≥ 0,4KU)

Αντιδραστήριο 2       ( α-κετογλουταρικό   25mmol/l

                                    NADH                   1,2mmol/l )

Πρότυπο διάλυμα ουρίας   (80mg/dl)

Μέθοδος

Παρασκευή αντιδραστηρίου εργασίας: Σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα μεταφέρουμε 12ml από το Αντιδραστήριο 1 και 3ml από το αντιδραστήριο 2, το οποίο θα χρησιμοποιηθεί και από τις δύο ομάδες του πάγκου.

Σε δύο δοκιμαστικούς σωλήνες τοποθετούμε το αντιδραστήριο, το πρότυπο και το δείγμα όπως υποδεικνύει ο Πίνακας:

 

	Τυφλό	Πρότυπο	Δείγμα
Πρότυπο διάλυμα	-	20μl	-
Δείγμα	-	-	20μl
Αντιδραστήριο εργασίας	2ml	2ml	2ml

Αναμιγνύουμε και επωάζουμε πάνω στον πάγκο για 1min. Φωτομετρούμε και καταγράφουμε τις απορροφήσεις Α1 του τυφλού, του προτύπου και του δείγματος. Μετά από 1min ακριβώς καταγράφουμε τις απορροφήσεις Α2 του τυφλού, του προτύπου και του δείγματος.

Προσδιορίζουμε τη ΔΑ=Α1-Α2 του τυφλού, του προτύπου και του δείγματος.

Αφαιρούμε τη ΔΑ του τυφλού ΔΑ από τις ΔΑ του προτύπου (προκύπτει η ΔΑ_{προτύπου}) και του δείγματος (προκύπτει η ΔΑ_{δείγματος}) και προσδιορίζουμε τη συγκέντρωση της ουρίας από τη σχέση

ΔΑδείγματος

 

ΔΑπροτύπου

C = 80 x                                  (mg/dl)

Τιμές αναφοράς:        10-50 mg/dl

                       

ΠΕΙΡΑΜΑ 2. Προσδιορισμός κρεατινίνης στον ορό του αίματος

Αρχή της Μεθόδου

Η μέθοδος είναι χρωματομετρική, χωρίς απολευκωμάτωση, και βασίζεται στην αντίδραση της κρεατινίνης με το πικρικό οξύ, ένα ασθενές οξύ, σε αλκαλικό περιβάλλον και στο σχηματισμό έγχρωμου συμπλόκου. Η αύξηση της απορρόφησης του συμπλόκου είναι ανάλογη με την ποσότητα της κρεατινίνης στο δείγμα.

Κρεατινίνη + Πικρικό οξύ                                           Σύμπλοκο κρεατινίνης-πικρικού

Υλικά

Αντιδραστήριο 1 (NaOH 160mmol/l)

Αντιδραστήριο 2 (Πικρικό οξύ 13,9mmol/l)

Πρότυπο δάλυμα κρεατινίνης 2mg/dl

Ορός αίματος

Φωτόμετρο

Μέθοδος

Παρασκευή αντιδραστηρίου εργασίας: Σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα αναμιγνύουμε 8ml από το Αντιδραστήριο 1 με 2 ml από το αντιδραστήριο 2, το οποίο θα χρησιμοποιηθεί και από τις δύο ομάδες του πάγκου.

Σε δύο δοκιμαστικούς σωλήνες τοποθετούμε το αντιδραστήριο, το πρότυπο και το δείγμα όπως υποδεικνύει ο Πίνακας:

	Πρότυπο	Δείγμα
Πρότυπο διάλυμα	200μl	-
Δείγμα	-	200μl
Αντιδραστήριο εργασίας	2ml	2ml

Αναμιγνύουμε και επωάζουμε πάνω στον πάγκο (σε θερμοκρασία δωματίου) για 30sec. Ρυθμίζουμε το φωτόμετρο στα 492nm. Μηδενίζουμε με απεσταγμένο νερό. Παίρνουμε τις απορροφήσεις του προτύπου και του δείγματος (Α1). Μετά από 2 λεπτά ακριβώς παίρνουμε ξανά τις απορροφήσεις του προτύπου και του δείγματος (Α2).

Υπολογίζουμε τη συγκέντρωση της κρεατινίνης με τον εξής τύπο:

ΔΑδειγμ

 

ΔΑπροτ

C = 2  x                         (mg/dl),     όπου ΔΑ = Α2 - Α1

Τιμές αναφοράς:        Άνδρες     0,6 - 1,4mg/dl

                                    Γυναίκες   0,5 - 1,1mg/dl

ΠΕΙΡΑΜΑ 3. Προσδιορισμός ουρικού οξέος στον ορό

Αρχή της μεθόδου

Ο προσδιορισμός του ουρικού οξέος γίνεται με τη βοήθεια της αντίδρασης με το ένζυμο ουρικάση. Το παραγόμενο υπεροξείδιο του υδρογόνου αντιδρά με το υδροξυ-βενζοσουλφονικό οξύ (DCHBS) και την 4-αμινοφαιναζόνη, παρουσία της υπεροξειδάσης, και παράγεται μια κόκκινη-βιολετί κινονεϊμίνη.

Ουρικάση

Ουρικό οξύ + Ο₂ + 2Η₂Ο                                  αλλαντοΐνη + CO + H₂O₂

Υπεροξειδάση

2 H₂O₂ + 3,5-διχλωρο-2-υδροξυ-βενζενσουλφονικό οξύ +

4-αμινοφαιναζόνη                                          έγχρωμη κινονεϊμίνη + HCl + 4 Η₂Ο

Υλικά

Αντιδραστήριο

            Φωσφορικό ρυθμιστικό (pH=5,0, 50mmol/l)

            4-αμινοφαιναζόνη (0,3mmol/l)

            3,5 DCHBS (4mmol/l)

            Υπεροξειδάση (100U/l)

            Σταθεροποιητές (500U/l)

Πρότυπο διάλυμα ουρικού οξέος 8mg/dl

Ορός αίματος

Φωτόμετρο

Μέθοδος

Σε τρεις δοκιμαστικούς σωλήνες τοποθετούμε το αντιδραστήριο, το πρότυπο και το δείγμα όπως υποδεικνύει ο Πίνακας:

	Τυφλό	Πρότυπο	Δείγμα
Πρότυπο διάλυμα	-	50μl	-
Δείγμα	-	-	50μl
Αντιδραστήριο εργασίας	2ml	2ml	2ml

Αναμιγνύουμε και επωάζουμε πάνω στον πάγκο (σε θερμοκρασία δωματίου) για 20min. Ρυθμίζουμε το φωτόμετρο στα 510nm. Μηδενίζουμε με το τυφλό και παίρνουμε τις απορροφήσεις του προτύπου (Aπροτ) και του δείγματος (Aδειγμ). Η ένταση του χρώματος παραμένει σταθερή για 15 λεπτά.

Υπολογίζουμε τη συγκέντρωση του ουρικού οξέος στον ορό  με τον παρακάτω τύπο:

Aδειγμ

 

Aπροτ

C = 8 x                              (mg/dl)

Τιμές αναφοράς:    Άνδρες      3,4 - 7mg/dl 

       Γυναίκες    2,4 - 5,7mg/dl

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ

1.    Να προσδιορισθεί η συγκέντρωση της κρεατινίνης στο δείγμα ορού που θα σας δοθεί και να εκτιμηθεί εάν είναι φυσιολογική

2.    Να προσδιορισθεί η συγκέντρωση του ουρικού οξέος στο δείγμα ορού που θα σας δοθεί και να εκτιμηθεί εάν είναι φυσιολογική